香气是食品风味的重要组成部分，是食品特征风味的来源之一。香气化合物的分子质量比较小（＜400 Da），最重要的包含醛类、酮类、醇类、酯类、羧酸、含硫化合物、呋喃和吡嗪等。 蛋白质被公认为食品中的营养和功能成分，除了作为食品的风味前体物质外，能够最终靠物理截留方式抑制香气化合物的动态变化，或通过种种相互作用力影响食品中香气化合物的保留与释放。

  蛋白质与香气化合物之间的结合作用最重要的包含非共价键合、共价键合和传质效应，但由于食品组织架构的复杂性以及蛋白质和香气化合物的自身特性和结构差异，两者结合作用的本质与规律性研究仍是一个系统且复杂的过程。基于此，上海应用技术大学香料香精技术与工程学院的陈臣、周琪琪、田怀香*等人综述了蛋白质与香气化合物的结合机制、测定方法和常用理论模型的研究进展，并探讨了影响蛋白质-香气化合物结合作用的重要的因素。在此基础上，提出了改善风味与蛋白质结合能力的对策，以期为利用新工艺生产风味优良的健康食品提供思路。

  根据结合方式的不同，蛋白质主要通过非共价键合、共价键合和传质效应3 种方式实现对挥发性成分的吸附（图1），进而改变顶空中香气化合物的浓度。其中，蛋白质与香气化合物的非共价键合作用主要由疏水相互作用、范德华力、氢键和静电相互作用力来提供，这些作用方式均是可逆结合，常应用于减少工艺流程的风味损失，并使风味成分在食用过程中重新释放。

  蛋白质-香气化合物结合过程中存在可逆的非共价键合作用和不可逆的共价键合作用。共价键合作用最重要的包含醛基（—CHO）、羰基（C＝O）与氨基酸残基（—NH2和—SH）的共价交联。研究表明，随着胰蛋白酶含量的增加，肌球蛋白对醛、酮类化合物的吸附能力增强，主要是由于氨基活性、巯基含量的增加等导致蛋白质的二级结构展开，从而增强了蛋白与挥发性成分的结合行为。含硫氨基酸中的巯基既可以参与维持蛋白质结构稳定的二硫键的形成，也可以与香气化合物发生共价结合。另外，赖氨酸残基侧链的ε-氨基也会与醛类化合物通过形成席夫碱发生结合。此外，一些胺类挥发物与天冬氨酸、谷氨酸的末端羧基之间形成酰胺键，也属于共价键合。这些结合作用的形成速度或慢或快，均能够导致食品风味特征的变化。

  香气化合物在不同相之间的传质阻力会受到基质质地与微观结构的影响，进而导致分配系数和分子迁移率不一样。蛋白基质黏度的增加或形成的凝胶结构均会产生传质效应，从而减缓香气物质在食用过程中的释放。其中，增加黏度不仅会阻碍食品组分的混合，而且会阻碍香气化合物在口腔中的流动，以此来降低挥发性物质释放到口腔的表面浓度。此外，蛋白质发生凝胶化也会减少风味物质的释放，因此导致香气强度降低。不一样的种类的食品球状蛋白（如乳清蛋白和大豆球蛋白等）加热后发生变性，结构展开，通过暴露的活性位点相互作用，形成具有三维网络结构的凝胶，进而对香气化合物产生物理截留。因此，通过改变挥发性成分的传质阻力可在某些特定的程度上改变风味的整体平衡，最终对风味的释放产生有利影响。

  依据分析原理，可将蛋白质-香气化合物结合作用的研究方法大致分为基于香气化合物顶空浓度、基于蛋白质构象变化以及基于蛋白分子与香气配体间结合位置的测定方法。其中，通过监测体系中香气化合物顶空浓度和蛋白质构象变化的测定方法往往需要理论模型加以辅助分析，进而反映蛋白质-香气化合物的结合作用程度。此外，新兴的分子对接模拟技术可以在一定程度上完成蛋白质-香气化合物结合作用位点和作用方式的可视化，从而直观地展现蛋白质与香气配体间的结合作用。因此，上述4 种研究方法与理论模型是定性和定量分析某种蛋白质和特定香气物质结合作用的方法基础。

  香气化合物在顶空中的浓度可以预估人在进食过程中的风味感知程度，顶空分析法基于气-液分配系数，结合气相色谱-质谱（GC-MS）分析被大范围的应用于去香食品基质对香气化合物结合能力的研究。常用方法最重要的包含静态顶空（SH）分析法和顶空-固相微萃取（HS-SPME）法。采用SH法对蛋白质-香气物质结合做多元化的分析，基于香气化合物与蛋白质的结合亲和力（K1）以及气相与水相之间的风味分配系数（K2）。

  SPME-GC/MS法能够测定食品中挥发性风味成分的浓度，并通过分析模型拟合，以计算出蛋白质内部结合位点个数（n）和结合常数（K）值，被大范围的应用于研究蛋白质与香气化合物的结合作用。当香气物质与水溶液中的蛋白质结合时（图2），顶空中挥发物质的浓度发生明显的变化，这能够最终靠色谱图中峰面积的变化来监测。

  当香气化合物分子带有极性基团时，在与蛋白结合时会引起蛋白质构象的改变。蛋白质与香气物质的结合作用一般会用结合位点n、结合常数K以及分配系数Ka、熵变ΔS、焓变ΔH和吉布斯自由能ΔG等热力学参数来表征。因此，能够正常的使用多光谱技术来阐明活性结合位点和结合作用类型，常用技术最重要的包含紫外-可见吸收光谱、荧光猝灭光谱、同步荧光光谱、圆二色光谱、傅里叶变换红外光谱和拉曼光谱等技术（表1）。

  蛋白分子结合香气化合物前后的紫外-可见吸收光谱变化能够反映蛋白质的色氨酸和酪氨酸残基周围微环境的变动情况，从而可判断蛋白分子与香气化合物是否发生了结合作用。

  荧光猝灭光谱法常用于进一步研究蛋白质与香气化合物的结合模式，其中荧光强度能够反映蛋白质内部微环境亲水-疏水平衡的变化，进而结合Stern-Volmer方程对荧光数据来进行分析，以计算得到结合位点和结合常数。其次，同步荧光光谱法可以反映特定氨基酸所处的微环境极性，也常用以分析蛋白质构象的变化。根据前人的研究，荧光猝灭光谱法和同步荧光光谱法往往需要热力学方法辅助从而判断两者作用过程的主要驱动力，进一步探究蛋白质和香气化合物的结合机理。

  不同于荧光光谱法，圆二色光谱法能够获得蛋白质中各二级结构的相对含量，进而推测出蛋白质构象的伸展与折叠，以及蛋白质内部氢键网络结构的变化情况。

  区别于上述光谱方法，傅里叶变换红外光谱法通常根据酰胺I（1 600～1 700 cm -1 ）、酰胺II（1 550 cm -1 附近）和酰胺III（1 200～1 350 cm -1 ）谱带来表征蛋白质结构的变化，并且可用于分析不同的状态、浓度等环境下蛋白质二级结构及其内部氢键变化的情况。He Yujia等通过傅里叶变换红外光谱法观测到醛类化合物和温度对肌球蛋白的酰胺III带均有显著影响，通过特定波长下吸收峰的移动能够判断出肌球蛋白与己醛、辛醛和3-甲基丁醛相互作用均改变了蛋白质的构象。

  此外，拉曼光谱法可以获取蛋白质的主链构象，特别是酰胺I带、酰胺III带和C-N等的伸缩振动信息；也能够获得侧链基团微环境的变动情况以及计算蛋白质的二级结构含量。

  香气化合物的顶空浓度、荧光强度以及猝灭速率常数并不能充分反映蛋白质-香气化合物的结合作用程度，因此，在研究二者结合能力时需要热力学理论模型加以辅助计算出结合常数K值和结合位点n值。描述蛋白质-香气化合物结合作用的理论模型对于定性和定量分析蛋白质与香气化合物的结合作用类型、作用位点个数和结合力大小是必不可少的。目前，分析蛋白质与香气化合物结合作用的模型通常分为3 种：1）Klotz方程，常用于分析结合位点固定、较低浓度的香气化合物与蛋白质的线）Hill方程，适用于分析结合位点发生明显的变化、浓度较高香气化合物与蛋白质的非线）Stern-Volmer、Van’t Hoff或Kirchhoff方程，用来分析蛋白质构象变化，通过结合参数来表征蛋白-香气的结合作用。

  式中：m为每摩尔蛋白质结合的香气化合物的量；[L]为水溶液中自由香气化合物的浓度/（mol/L）；K为结合常数/（L/mol）；n为结合位点的个数；h为希尔系数，反映蛋白质结构改变的程度。

  式中：O为香气化合物总浓度/（mol/L）；C p 为蛋白质浓度/（mol/L）；[HS] p 为含蛋白质样品的顶空香气化合物GC峰面积；[HS] c 为不含蛋白质样品顶空香气化合物GC峰面积。

  另外，基于蛋白质构象发生明显的变化时，常使用的Stern-Volmer方程及其修正后可用于计算结合位点n值和静态猝灭平衡常数Ka的方程分别公式（5）、（6）所示。

  式中：F 0 和F分别为不存在和存在猝灭剂时的荧光强度；K sv 为荧光猝灭常数/（L/mol）；[Q]为猝灭剂的浓度/（mol/L）；K sv 能够最终靠对F 0 /F与[Q]的线性回归关系曲线来确定。

  采用的分析模型、香气化合物浓度、研究体系等不同，所获得的研究结果也不完全一样。刘璘等基于热力学模型（Scatchard方程）的研究表明，肌球蛋白与白鲢鱼特征腥味物质的结合反应均是自发的（ΔG＜0）。与直链醛（庚醛、辛醛、壬醛）相比，1-辛烯-3-醇和肌球蛋白的结合位点数（n）更多及结合常数（K）较大，且肌球蛋白对直链醛的结合能力随着链长的增加而有所降低。有研究表明，基于Klotz模型，香茅醛、丙酸香茅酯、乙酸香茅酯和香茅醇在低浓度时（0.04～0.16 mmol/L）与大豆分离蛋白的结合较小，两者为线性结合，而Hill模型分析结果则与之相反。另外，基于构象变化，采用Kirchhoff方程能够计算熵变ΔS、焓变ΔH和吉布斯自由能ΔG，进而推导出结合常数K和结合位点n。此外，利用Stern-Volmer方程，并根据猝灭速率常数也可以计算得到结合常数K值和结合位点n值。由于大多数蛋白质-香气物质的作用都是可逆的非共价结合，研究者倾向于使用Klotz（或Scatchard）方程和Hill方程两种经典理论模型，在平衡条件下来描述香气化合物与蛋白质的结合能力。

  分子对接是研究分子间（配体和受体）相互作用并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。分子动力学模拟能够克服对接分析中严格的采样限制，利用计算机以原子水平的分子模型来模拟分子结构和行为，进而模拟分子体系的各种物理、化学性质。近年来，分子对接和分子模拟慢慢的变多地被用于食品领域，为蛋白分子与香气化合物间的结合作用研究提供了一种新思路和新工具。Liu Chengzhi等利用分子动力学模拟探索玉米醇溶蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的结合作用机理（图3）。图中残基的能量贡献小于-8.37 kJ/mol显示为橙色，能量贡献大于-8.37 kJ/mol显示为黄色，而左侧紫色虚线则代表氢键。分子动力学模拟根据结果得出，EGCG与Y171、Q174、L176和L205残基生成的玉米醇溶蛋白活性口袋结合。其中，静电相互作用和范德华力在EGCG与玉米醇溶蛋白的结合中起主导作用，这与傅里叶变换红外光谱和热力学分析的结果一致。

  蛋白质-香气化合物的结合作用受到多种因素的影响，除了温度、pH值、离子强度和氧化条件等外因可以通过改变蛋白质结构来影响蛋白质与香气物质的结合作用，食品中的蛋白质、香气化合物及其他配料组分差异也会使蛋白质的结构和聚集状态发生明显的变化，进而影响蛋白质的结合能力。目前，关于温度、pH值和蛋白质氧化等加工条件怎么样影响蛋白质-香气化合物结合能力的总结已较为系统全面，因此，本文主要围绕食品基质中蛋白质的种类与结构、香气化合物的浓度、种类与官能团以及食品中的配料成分差异对蛋白质-香气化合物结合作用的影响进行阐述，以深入解析二者结合作用机制。

  目前对蛋白质与香气化合物结合作用的研究大多分布在在动物蛋白，包括乳蛋白（β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和酪蛋白）、牛血清白蛋白和肌原纤维蛋白。表2总结了近几年来发表的文献中所选择的香气化合物与不同蛋白质的结合作用。蛋白质种类的不同，特别是氨基酸残基、二级结构等均有所差异，能够影响其与香气化合物作用时所表现的结合能力强弱。

  乳蛋白最重要的包含酪蛋白和乳清蛋白，其中乳清蛋白主要由β-乳球蛋白（约80%）和α-乳白蛋白组成。由于β-乳球蛋白体积小、水溶性好、结构和性质明确，因此广泛作为模型用于研究香气化合物-蛋白质的结合作用。酪蛋白由于自身结构的特殊性，有关其与香气化合物结合作用的研究较少，且一般都是在模拟体系中完成。

  肌肉蛋白是一种复合体系的蛋白质，研究较多的主要是肌球蛋白和G-肌动蛋白等肌原纤维蛋白。 。除此之外，当添加酮类化合物后，肌原纤维蛋白的构象发生了改变，α-螺旋含量相应减少，Tyr和Trp残基周围微环境的极性增强。

  与动物蛋白不同的是，大豆蛋白因不良“草味”或“豆腥味”限制了其应用和消费。因此，许多研究都集中在了解大豆蛋白异味的释放和结合上。研究表明，醇类（如1-己醇）和醛类（如己醛）与干大豆蛋白的结合能力高于烃类（如己烷），这可能是由于大豆蛋白与醇、醛类化合物形成了氢键相互作用。然而，除大豆蛋白外，对其他植物蛋白及其风味结合能力的系统研究还比较缺乏。

  研究表明，蛋白质的结构，特别是其氨基酸序列、二级、三级和四级结构是影响其与香气化合物结合的主要的因素。黄国等研究中性条件下β-伴大豆球蛋白（7S）、大豆球蛋白（11S）与EGCG的结合作用。相比于7S蛋白，11S蛋白中疏水性和不带电荷的氨基酸含量较高，说明11S蛋白对EGCG的结合能力更强。α-乳白蛋白的致密结构含有26%的α-螺旋、14%的β-折叠和60%的无序结构，能够抑制疏水性区域的暴露，以此来降低蛋白质与香气物质的结合能力。甲基化、乙基化、二硫键断裂、糖基化和脱酰胺基等均会导致蛋白质肽链展开和聚集，从而引发其与香气化合物结合作用的改变。对蛋白质的可暴露疏水区域进行物理和化学修饰，能大大的提升其结合风味的能力。

  香气化合物浓度对自身与蛋白质作用的结合位点和结合常数有很大的影响。通过Hill模型分析可得，随着香气化合物浓度增大，其与蛋白质的结合能力增强，引起蛋白质去折叠或肽链展开，由此产生新的结合位点。当香气化合物为低浓度时，其与蛋白质结合能较低，一般难以真实地反映蛋白质内部对香气化合物的结合情况，特别是内部疏水区较封闭的大豆分离蛋白，蛋白质的构象并不会发生明显的变化。蛋白质内部结合香气化合物浓度通常较低，结合强度高，释放量较少，因此研究者常使用SPME-GC/MS方法测定顶空中香气化合物浓度，再通过数学模型拟合，进而得到蛋白质内部结合位点。

  许多研究都更加关注香气化合物对蛋白质结合位点数量和分布的影响，其中香气化合物的种类和官能团对二者之间的结合作用具有非常明显影响。整体看来，研究者倾向于认为香气化合物与蛋白质的结合强度大小依次为醛类＞酯类＞酮类＞醇类。当香气化合物为同系物时，其与蛋白质的结合能力随着脂肪链长度的增加而增强。

  食品是包含多种成分的复杂体系，存在别的配料成分，如油脂、乳化剂、盐和调味用糖等，这些配料或多或少地会影响蛋白质的聚集状态和构象等特性，从而对蛋白-香气化合物的结合作用产生一定的影响。一般来说，蛋白质对挥发性风味物质的保留率远低于脂肪。

  蛋白质与香气化合物的结合作用会直接或间接影响食品的风味感知，进而影响花了钱的人食品的喜好程度。此外，食品制造业中蛋白质-香气化合物反应会造成风味损失或者异味存留，从而缩短产品保质期，因此，了解蛋白质与香气化合物的结合作用机制及影响因素，为保持食品理想的风味和延长产品保质期提供了可能。

  随着精密仪器与技术的持续不断的发展，研究手段与方法的不断成熟，对蛋白质与香气化合物结合作用的认识也逐渐深入。然而目前还存在一些问题，需要在目前的认知基础上进一步强化。首先，目前蛋白基质与香气成分的结合作用研究一般都是在单一的模拟体系中完成，它们之间的结合类型与作用位点等作用方式尚不明确，且不存在统一的作用机制。因此，在研究单一基质的基础上，进一步研究复合体系和多组分食品基质与香气化合物的相互作用是未来研究的发展的新趋势之一。其次，关于蛋白质在加工时构象变化、不同结构的香气化合物共存条件下以及添加食品配料等对蛋白质与香气化合物结合作用影响等方面的研究仍有所欠缺，进而导致蛋白食品体系中风味平衡调控技术的缺乏。此外，随着消费者追求饮食中少盐、少糖，同时对低脂食品的需求增加，应加速探索开发植物性和“三减”食品的方法。但是“三减”食品的风味成分持续释放能力也会减弱，如何在这种情况下保持食品的风味也显得至关重要。如开发植物胶或以蛋白质为基础的脂肪替代品，并通过添加调味料或改变香气化合物的释放/保留模式来保持食品的风味特征，均是满足健康饮食需求的可选策略。与此同时，也需要深入研究感官评价和蛋白质-香气化合物结合作用程度之间的关系，以期在蛋白质与香气化合物结合作用机理的研究基础上揭示食品风味在体内和体外的释放机制。食品中蛋白基质与香气化合物的结合能力决定了食品的风味品质，随着蛋白质与不同香气化合物结合作用机理研究的不断深入，蛋白质-香气化合物的结合方式和特有的保留/释放模式将逐渐明晰，这对于挥发性香气成分的可控释放及感知并实现风味品质稳态化调控具备极其重大的意义。

  本文《蛋白质-香气化合物结合作用的研究方法及影响因素研究进展》来源于《食品科学》2023年44卷17期178-187页. 作者：陈臣，周琪琪，于海燕，娄新曼，李永，田怀香. DOI:10.7506/spkx0603-035. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

  田怀香，女，1976.5—，博士，现任上海应用技术大学人事处处长，香料香精化妆品学部教授，上海食品风味与品质控制工程技术研究中心主任，“国家一流本科专业建设点”食品科学与工程专业负责人，博士生导师，食品风味调控创新团队负责人，上海市曙光学者，上海市优秀技术带头人。主要是做食品风味化学、食用香精、新型乳制品研究。先后主持国家自然科学基金面上项目、青年基金项目、上海市科委重点项目、上海市自然科学基金和上海市教委曙光计划等项目13 项，横向企业项目20 项，主持项目近800万元。荣获2021年度中国食品科学技术学会科学技术创新奖杰出青年奖，获得2021年度中国轻工业联合会科学技术进步奖一等奖、2017-2018年度上海市三八红旗手等。以第一或通讯作者发表学术论文152篇，被SCI收录论文77篇，申请专利115项，授权专利19项。兼任中国食品科学技术学会第三届青年委员会委员、中国食品科学技术学会食品添加剂分会第四届理事会、中国畜产品加工研究会第七届理事会理事、上海市食品学会乳品专业委员会副主任委员，并担任国内外多个学术期刊编委及审稿人。

  陈臣，男，1982.11—，博士，教授，上海应用技术大学科学技术探讨研究院副院长，硕士生导师，上海市高层次人才计划、上海五四青年奖章和上海市科技启明星获得者，加拿大阿尔伯塔大学访问学者。研究方向为食品生物技术、食品风味化学。目前共主持科研项目近20项，包括国家自然科学基金面上项目1项，青年项目1项，省部级项目5项，其他纵向4项，企业横向8项，总经费500余万。获得中国轻工业联合会科技进步一等奖（2021年，R2）和2014年上海市科学技术进步奖一等奖1项（2014年，R10）。以第1及通讯作者发表论文80余篇，其中SCI 40篇（二区以上25篇，他引1200次），EI 13篇。共申请发明专利90余项，其中授权28项，主编教材1部，参编著作3部。担任上海食品风味与品质控制工程技术研究中心副主任，兼任上海食品学会第二届青年委员会副秘书长、乳酸菌专业委员会委员、中国食品学会果蔬分会理事，担任《食品制造业科技》青年编委、《食品研究与开发》青年委员、《应用技术学报》青年编委、《食品安全质量检验学报》青年编委，JAFC、Food Microbiology、Journal of Dairy Science、LWT、《食品科学》等十几个国内外期刊审稿人。

  实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

  ：中国农业大学李媛教授等：提高益生菌耐加工贮藏稳定性和体内存活率的递送系统研究进展